钩吻(Gelsemium elegans Benth.)为马钱科(Loganiaceae)钩吻属(Gelsemium)的一种常绿木质藤本植物，在我国主要漫步于湖南、广东、广西等南边地区[1]，是我国的一种传统药用植物。其始载于《神农本草经》，别号为断肠草、胡蔓藤和大茶药等黄sei大片全集，全株剧毒，主祛风攻毒、散结消肿之效，其活性要素为生物碱、环烯醚萜类和黄酮类等要素[2-3]，可外敷调整皮炎、湿疹，在临床上能阻扰多种癌细胞的滋长增殖，还具有免疫蜕变、抗肿瘤、镇痛稳重和抗蹙悚等作用[4-5]。钩吻看成一种剧毒植物，被猪、羊等畜类适量食用不错驱虫、增多食欲[6]，东说念主若口服则极易引起中毒，但据接头标明，其调整剂量与中毒剂量左近[5]，因此也受到国表里的普通温雅，具有迫切的接头价值。咫尺，对钩吻的接头主要聚首于化学要素的索要与漂荡[7-8]、药理及毒理机制[9-10]等地方，而关于钩吻生物碱的生物合成阶梯关系接头甚少，因此，推崇钩吻生物碱生物合要素子机制的接头，领略合成阶梯中要道酶基因的调控机制，将为钩吻的开辟与诈骗奠定基础。

及时荧光定量PCR本事(quantitative real- time PCR， qRT-PCR)能通过荧光信号的累积及时监测到DNA扩增反应的居品总量并进行定量分析[11-12]，是接头和分析基因相对抒发水平的迫切本事之一，因其具有明智度高、可相易性强、特异性好且易于操作等特质，在内参基因筛选的接头中，具有迫切作用[13]。但由于该本事的收尾准确性和踏实性还受引物特异性等诸多因素影响，需引入内参基因对qRT-PCR所得数据进行均一化措置[14]。通常看家基因抒发踏实，不易受环境影响，常被用作qRT-PCR分析的内参基因。植物中常见的看家基因有18S核糖RNA (18S)、肌动卵白基因(Actin)、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、α微管卵白基因(TUA)、延迟因子基因(EF1-α)、SAND家眷卵白基因(SAND)和细胞分裂死心卵白基因(cdc25)等。在诸多接头中发现，不同植物间看家基因的抒发踏实性也不同。如Wang等[15]接头发现PPA2是何首乌不同组织中最好的看家基因；Teng等[16]接头发现CYP和GAPDH是大花红景天用于qRT-PCR的最适看家基因；Yang等[17]通过实验发现ACT7和PP2A是铁十字秋海棠斑叶在不同期期抒发踏实性最优的看家基因。咫尺，仍莫得关于钩吻内参基因的筛选接头。因此，筛选出钩吻qRT-PCR分析中最好的内参基因对后续的基因抒发及分析具有迫切意思。

接头发现，从钩吻植株等分离出来的毒性要素为钩吻生物碱，属于萜类吲哚生物碱(terpenoid indole alkaloids， TIAs)[18]，其中含量最高的要素是钩吻素子(koumine)[19]，毒性最强的为钩吻素己(gelsenicine)[20]。钩吻碱看成钩吻的主要活性要素，应用远景相配普通，推崇其生物合成阶梯，了解阶梯上的关系酶基因，故意于通过合成生物学等技能，耕种钩吻碱的产量，拓宽钩吻的应用商场。吲哚类生物碱的合成主要波及环烯醚萜阶梯和色胺阶梯。来自甲基-d-赤藓醇-4-磷酸阶梯(MEP pathway)的前体异戊烯二磷酸(isopentenyl diphosphate， IPP)和二甲烯丙基二磷酸(dimethylallyl diphosphate， DMAPP)[21-22]，在香叶基焦磷酸合酶(geranyl diphosphate synthase， GPPS)、香叶醇合酶(geraniol synthase， GES)的催化下区别生成香叶基二磷酸酯(geranyl diphosphate)[23]和香叶醇(geraniol)[24]，接着通过环烯醚萜阶梯(iridoid pathway)参与氧化、复原等反应，生成马钱子酸(loganic acid)[25-26]，再经由番木鳖酸甲基出动酶(loganic acid methyltransferase， LAMT)及裂环马钱子苷合成酶(secologanin synthase， SLS)的共同催化得到断马钱子苷(secologanin)[27-28]；分支酸(chorismate)在色胺阶梯(tryptamine pathway)中多种酶的催化下，能得到色胺(tryptamine)[29]。至此，通过异胡豆苷合成酶(strictosidine synthase， STR)催化，断马钱子苷和色胺缩合酿成胡豆苷(strictosidine)[30]。终末，异胡豆苷通过异胡豆苷β-d-葡萄糖苷酶(strictosidine-β-d-glucosidase， SGD)脱糖[31]，再经过细胞色素P450酶(cytochromeP450， CYP450)和N-甲基出动酶(N-methyltransferase， NMT)催化，最终身成钩吻中剧毒要素——钩吻素己，其生物合成阶梯及波及的关系基因见图 1。

av巨乳

基于本课题组前期已完成的基因组测序[32]，发现了大王人钩吻TIAs生物合成阶梯上的关系酶基因，并基于基因组和转录组数据筛选出了钩吻10个候选看家基因，通过使用GeNorm、NormFinder、BestKeeper、Delta CT (ΔCT)和RefFinder分析候选看家基因在钩吻不同部位的抒发踏实性。然后诈骗筛选出的最面子家基因对参与钩吻素己生物合成上游阶梯关系酶基因的抒发款式进行分析，以进一步考据该看家基因的准确性，并为后续接头钩吻生物碱合成要道酶基因的功能考据奠定基础。

1 材料与行为 1.1 材料

本接头所用钩吻G. elegans采自广西壮族自治区柳州市柳城县龙头镇新村，剪取钩吻4个不同部位(根皮、茎段、叶片、花序)植物材料。剪取后，经浅薄清算后马上切片，置于液氮中速冻，−80 ℃以下雪柜保存备用。

接头中所用仪器主要有Agilent 6530 LC-MS系统(Agilent Technologies， Palo Alto)、qTower3G及时荧光定量PCR仪，Analytik Jena公司。

1.2 行为 1.2.1 钩吻生物碱基于LC-MS本事的相对含量分析

将簇新钩吻样品用液氮充分研磨后，置于LGJ-10C冷冻干燥机(四环福瑞科仪科技发展有限公司)内干燥，备用。称取钩吻粉末1 g，加入80%酒精(体积分数) 25 mL，于60 ℃超声机中超声30 min，得滤液，滤渣再加入80%酒精25 mL，再次超声30 min，合并2次滤液。待滤液散至无酒精味后，取1 mL滤液，氮气吹干，加入200 μL洗脱液(A)和800 μL洗脱液(B)复溶，过0.22 μm滤膜，待分析。

使用Agilent 1290高效液相色谱串联时辰飞行(6530)质谱仪(Agilent公司， LC-QqTOF/MS)检测样品，样品在Waters C18柱(3.5 μm， 4.6 mm× 150 mm)上分离。流动相为0.1%甲酸-乙腈，分析时辰50 min，使用梯度洗脱模范：0−2 min，10%−10% (B)；2−7 min，10%-15% (B)；7− 30 min，15%−45% (B)；30−40 min；45%−90% (B)；40−43 min，90%−90% (B)；43.01−50 min，10%−10% (B)。流速为0.3 mL/min，柱温保捏30 ℃，进样体积为5 μL。取舍自动二级款式进行样品分析，(+) ESI；闹翻电压，30 V；毛细管电压，3 500 V；干气温度，300 ℃；鞘气温度，350 ℃；使用干燥气体(N2)看成雾化气体流量，9 L/min；鞘气流量，11 L/min；雾化器，35 psi；扫描限制：50−1 000 m/z。碰撞能量(CE)扶直为30 V。

通过测定，得到不同部位的质谱响应峰高，对不同部位中钩吻素己的相对含量进行要素分析。

1.2.2 总RNA的索要和cDNA合成

取舍多糖多酚植物RNA索要试剂盒(湖南艾科瑞生物工程有限公司)对钩吻4个部位区别进行总RNA索要。诈骗超微量分光光度计(K5600，北京凯奥科技有限公司)检测总RNA样品的浓度、OD260/OD280值及OD260/OD230值，然后取RNA各2.5 μL，用1%琼脂糖凝胶电泳仪检测，通过不雅察18S、28S条带亮度判断总RNA的完好性。4个部位均取舍200 ng RNA进行cDNA第一链合成，按照PrimerScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) 试剂盒(TaKaRa， 大连)评释书的操作设施进行，置于−20 ℃保存备用。

1.2.3 看家基因的筛选与引物合成

基于课题组已有的钩吻转录组数据，筛选出10个候选的看家基因18S、GAPDH、Actin、TUA、TUB、SAND、EF-1α、UBC、UBQ和cdc25，另外，基于“基因组+转录组+代谢组”共抒发分析，筛选出钩吻生物碱生物合成已知上游阶梯中的共18个关系基因，区别通过Primer Premier 5.0软件进行qRT-PCR引物的瞎想(表 1和表 2)。引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.2.4 及时荧光定量PCR (qRT-PCR)

将不同部位样品的cDNA模板原液等量夹杂，按序稀释4倍，扶直5个浓度梯度，区别为模板原液的1、1/4、1/16、1/64和1/256，由于TUB、GAPDH基因的抒发量高，该2个基因取舍的浓度梯度，区别为模板原液的1、1/5、1/25、1/125和1/625。

qRT-PCR实验取舍SYBR® Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit (AG11701)试剂盒，操作设施按评释书进行，并使用qTower3G及时荧光定量PCR仪(Analytikjena公司)进行qRT-PCR反应，反应体系为20 μL：2×SYBR Green Pro Taq HS预混型10 μL (Vazyme)，cDNA 2 μL (共添加50 ng)，上、下流引物(浓度为10 μmol/L)各0.4 μL，RNase无菌水7.2 μL，配制经过在冰上完成。扩增反应模范为：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个轮回，每个样品进行3次相易检测，反应达成后由软件生成溶化弧线，字据溶化弧线判断引物的扩增特异性。

通过qRT-PCR反应，取得每个看家基因在不同梯度下的Ct值，生成圭臬弧线，运筹帷幄斜率(k)和线性关系总计(R2)，并诈骗公式E= (10−1/k−1)×100%运筹帷幄看家基因的扩增成果。同期，整理经过qRT-PCR反应所得数据，集聚10个候选看家基因的Ct值，并用2−ΔΔCt分析定量收尾。

1.2.5 看家基因抒发踏实性评价

区别使用GeNorm[33]、Normfinder[34]、BestKeeper[35]和ΔCT[36]这4个模范以及RefFinder网站在线[37]评估10个候选看家基因在钩吻不同部位的抒发踏实性。BestKeeper和ΔCT模范可径直取舍Ct值进行运筹帷幄分析，而使用GeNorm和Normfinder模范均需将所得Ct值先滚动为Q值[38]再分析，Q值为该基因在不一样品中的Ct值区别与在通盘样品中最小的Ct值之差。终末取舍RefFinder在线网站()联接上述4个模范的分析收尾进行详尽评价，以筛选出最面子家基因。字据筛选出的最面子家基因，对钩吻生物碱生物合成已知的上游阶梯关系基因在钩吻不同部位进行抒发款式分析，每个样品进行3次本事相易，并诈骗IBM SPSS Statistic 22软件进行互异显赫性分析。

2 收尾与分析 2.1 钩吻生物碱相对含量分析

字据峰高的响应值进行钩吻素己相对含量的分析，不错得出该要素在4个部位的相对趋势(图 2)。收尾显现，钩吻素己在钩吻根皮中含量较高，其次是花序和茎段，在叶片中含量最低。

2.2 钩吻总RNA索要及质地检测

凝胶电泳的成像收尾显现(图 3)，索要的总RNA均呈现显著亮堂的28S和18S条带，标明该总RNA的索要完好性较好。进一步使用超微量分光光度计检测发现，4个样品(根皮、茎段、叶片、花序)的总RNA浓度区别为32.6、94.4、105.8和188.9 ng/μL，通盘样品的OD260/OD280在2.10−2.17之间，OD260/OD230在1.60−1.85限制内。上述收尾标明，通盘样品总RNA的完好性较好且纯度较高，可在后续实验中使用。

2.3 候选看家基因qRT-PCR引物特异性履行

以稀释为5个浓度梯度的cDNA为模板，取舍qRT-PCR反应锻练10个候选看家基因的引物特异性，字据下机数据区别取得各看家基因的圭臬弧线。收尾显现(表 2)，10个看家基因的关系总计R2均大于0.99，引物的扩增成果均介于0.86%−1.09%之间，溶化弧线均为单一溶化峰(图 4)，且弧线平滑，莫得引物二聚体的存在。上述收尾标明，cDNA模板量与对应的Ct值呈现较好的线性关系，从低浓度至高浓度，逼对应Ct值均渐渐减小，合乎抒发划定；且各候选基因的引物特异性强，销亡样品相易性好，可伸开后续实验。

2.4 候选看家基因抒发丰采分析

对10个候选看家基因以不同部位的cDNA为模板进行qPCR实验，得到的Ct值可径直反馈各候选基因在各部位的抒发丰采，且Ct值越小，反馈出的基因抒发丰采越高。收尾显现(图 5)，通盘样品的Ct值均在16.65−25.18的区间内。其中，EF1-α的平均Ct值最小，通盘Ct值处于16.65−18.11的限制内，评释候选基因EF1-α在各部位的抒发丰采最高；SAND的平均Ct值最大，通盘Ct值介于24.14−25.18之间，评释候选基因SAND在各部位的抒发丰采最低。

2.5 候选看家基因踏实性分析 2.5.1 GeNorm分析

GeNorm模范在使用前，先将所得下机数据Ct值滚动为Q值，得到相对抒发量。该模范是通过候选看家基因的平均踏实指数M值的运筹帷幄，评价各候选基因的踏实性，M值的默许踏实性界线为M=1.5，且越低于1.5，候选看家基因越踏实[39]，反之则越不踏实，由此可判断各候选基因在钩吻不同部位的抒发踏实性。GeNorm软件分析收尾显现(图 6)，在钩吻的4个部位中，10个候选看家基因的抒发踏实性排序为Actin=UBC > UBQ > EF1-α > SAND > GAPDH > cdc25 > TUA > 18S > TUB。通盘候选基因的M值均小于1.5，评释通盘候选基因在4个不同部位中均抒发踏实，其中Actin和UBC的踏实性最好，TUB的踏实性最差。因此，还需要通过GeNorm模范运筹帷幄变异值(Vn/n+1)以便信服最好的看家基因数量。当Vn/n+1 < 0.15时，最适看家基因数达n个，反之则需要n+1个。如图 7所示，V2/3的比值小于0.15，评释关于钩吻的不同部位，看家基因数量最好为2个。

2.5.2 NormFinder分析

NormFinder模范同GeNorm模范分析相似，在使用前需将Ct值滚动为Q值，再通过该模范运筹帷幄得到10个候选看家基因的抒发踏实值M，得到候选基因在不同部位的踏实性变化，且M值越小，基因抒发踏实性越高。收尾标明(图 8)，10个候选看家基因的踏实性按序是：EF1-α > Actin > UBQ > SAND > UBC > GAPDH > TUA > cdc25 > 18S > TUB。其中，EF1-α的M值最小，即踏实性最好；TUB的M值最大，即踏实性最差。

2.5.3 BestKeeper分析

BestKeeper模范可径直输入候选看家基因的Ct值分析运筹帷幄，筛选出抒发踏实性好的候选基因。通过输入各候选基因在不同部位的CP (crossing point) (3次本事相易所得Ct值的几何平均数)，运筹帷幄得出各候选基因的圭臬偏差(SD)和变异总计(CV)[40]，以此分析候选看家基因的抒发踏实性。该模范默许SD=1为踏实性界线，SD越小，标明基因的抒发越踏实，若SD > 1，则该基因抒发踏实性较差；CV反馈的是候选看家基因在不同部位中抒发水平的变异进度，CV越小，变异进度越小[14]。收尾显现(图 9)，SD值的大小排序为：GAPDH < SAND < EF1-α < 18S < cdc25 < Actin < TUA < UBC < UBQ < TUB，评释GAPDH的抒发踏实性较好，TUB的抒发踏实性差；而CV值最小的是SAND，其次按序是GAPDH、18S、EF1-α、cdc25、Actin、TUA、UBC、UBQ，而TUB的CV值最大，评释SAND在不同部位的抒发水平变异进度最小，TUB的变异进度最大。详尽BestKeeper模范运筹帷幄的所少见据显现，在钩吻不同部位中抒发最踏实的候选基因为GAPDH，然后按序是SAND和EF1-α。

2.5.4 ΔCT分析

评估候选看家基因的抒发踏实性，不错通过运筹帷幄各候选基因Ct值的平均圭臬偏差来分析。平均圭臬偏差越小，基因在不同部位的抒发越踏实。ΔCT分析收尾显现(图 10)，在钩吻的4个部位中，10个候选看家基因的踏实性按序为：EF1-α=Actin > UBQ > UBC=SAND > GAPDH > cdc25=TUA > 18S > TUB。标明EF1-α和Actin的平均圭臬偏差最小，这2个基因在4个部位的抒发最踏实，而TUB的抒发踏实性最差。

2.5.5 RefFinder详尽踏实性分析

RefFinder在线网站粗略详尽GeNorm、NormFinder、BestKeeper及ΔCT4个模范的踏实性评价收尾进行评估，是基于对这4个模范的踏实性收尾取舍适合的权重分拨，并通过运筹帷幄几何平均数，得到基因抒发踏实性的详尽排行和指数[41]的一种行为。使用RefFinder网站，不错幸免单个模范分析的单方面性，对通盘候选的看家基因进行全面地分析，且候选基因排行越靠前、指数越小，抒发踏实性越好。RefFinder详尽分析收尾显现，10个候选看家基因的踏实性排序为EF1-α (1.86) > Actin (2.21) > UBC (3.56) > SAND (3.76) > GAPDH (3.83) > UBQ (3.95) > cdc25 (6.65) > 18S (7.35) > TUA (7.48) > TUB (10.00)。由此标明，EF1-α的抒发踏实性最好，TUB的抒发踏实性最差。因此，EF1-α的抒发水平及踏实性最好，不错看成qRT-PCR实验下关于钩吻不同部位的理思看家基因。

2.6 钩吻生物碱上游阶梯关系酶基因抒发分析

通过“基因组+转录组+代谢组”共抒发关联分析行为筛选出钩吻生物碱上游阶梯关系候选基因，该行为关于多基因或超基因家眷候选序列的筛选具有很高的预理性，不错愈加精确地对重心序列进行接头。以PRAI基因为例(图 11)，从基因组中共漂荡了9条PRAI候选基因序列，通过转录组、代谢组共抒发分析，发现存4条序列与钩吻素己的含量聚为一类，区别为contig5.924、contig29.88、contig22.428以及contig9.18，其中挑选了contig5.924看成重心候选序列进行了qRT-PCR分析。依此类推，取舍该款式对阶梯中其他17类基因进行了筛选，这么能灵验减轻基因功能考据的限制、耕种了筛选成果，这类筛选行为在本课题组前期接头罗汉果CYP450和糖基出动酶超基因家眷中取得了较好的考据[42-44]。在钩吻不同部位中，以EF1-α为看家基因，对钩吻素己生物合成上游阶梯中的关系酶基因进行了抒发款式分析。收尾按序为色胺阶梯上的邻氨基苯甲酸合酶(anthranilate synthase， AS， 图 12A)、邻氨基苯甲酸磷酸核糖出动酶(anthranilate phosphoribosyltransferase， AnPRT， 图 12B)、磷酸核糖邻氨基苯甲酸出动酶(phosphoribosylanthranilate isomerase， PRAI， 图 12C)、吲哚-3-甘油磷酸合酶(indole-3-glycerol phosphate synthase， IGPS， 图 12D)、色氨酸合成酶α链(tryptophan synthase alpha chain， TSA， 图 12E)、色氨酸合成酶β链(tryptophan synthase beta chain TSB， 图 12F)、色氨酸脱羧酶(l-tryptophan decarboxylase， TDC， 图 12G)；环烯醚萜阶梯中的香叶醇合酶(geraniol synthase， GES， 图 12H)、香叶醇8-羟化酶(geraniol 8-hydroxylase， G8H， 图 12I)、8-羟香叶醇脱氢酶(8-hydroxygeraniol dehydrogenase， 8-HGO， 图 12J)、环烯醚萜合酶[(S)-8-oxocitronellyl enol synthase， IS， 图 12K)]、7-去氧番木鳖酸合成酶(7-deoxyloganetic acid synthase， 7-DLS， 图 12L)、7-去氧番木鳖酸葡萄糖出动酶(7-deoxyloganetic acid glucosyltransferase， 7-DLGT， 图 12M)、7-去氧番木鳖酸羟化酶(7-deoxyloganate 7-hydroxylase， 7-DLH， 图 12N)、番木鳖酸甲基出动酶(loganate methyltransferase， LAMT， 图 12O)、裂环马钱子苷合成酶(secologanin synthase， SLS， 图 12P)；还有吲哚生物碱阶梯上的异胡豆苷合成酶(strictosidine synthase， STR， 图 12Q)及异胡豆苷β-d-葡萄糖苷酶(strictosidine-β-d-glucosidase， SGD， 图 12R)。

实验收尾标明，这些基因大部分抒发款式与全长转录组的抒发款式一致，评释了全长转录组测序收尾比拟准确。其中AS、PRAI、TSB、GES、IS、7-DLGT及SLS基因的抒发款式与钩吻素己含量变化趋势基本一致，在根皮和花序2个部位的抒发量较高，在茎段和叶片中的抒发量较低，尤其是AS、GES和IS在茎段的抒发量极低；IGPS、TDC、7-DLS、7-DLH、LAMT、STR及SGD基因的抒发款式相访佛，均为在茎段和叶片中的抒发量高，在根皮和花序中的抒发量低，且7-DLH基因在钩吻根皮中不抒发；AnPRT和8-HGO基因抒发款式一致，均为茎段抒发量最高，根皮和叶片次之，花序中抒发量最低；TSA基因主要在根皮中抒发，其次为叶片，在茎段和花序中抒发量进出较小；G8H基因在花序中的抒发量很高，在其他3个部位中微量抒发以致不抒发。在钩吻次生代谢物的累积经过中，这些酶通过影响阶梯上各代谢居品的含量与合成，进一步径直影响到终居品的积贮。

3 接头与论断

看家基因是一种在不同发育期间和不同环境下粗略踏实抒发的一种基因，通常王人与细胞的基础行为关系，比如Actin基因与细胞结构关系，cdc25基因与细胞周期的调控关系等[45]。连年来，国表里好多学者基于qRT-PCR本事对不同植物的看家基因进行了接头，并发当今不同植物或销亡植物不同组织部位、不同发育期间和其他非生物阻挡措置中，其看家基因的种类和抒发水平具有互异性[39]，是以通常看家基因并不在通盘植物中通用，需要进一步接头信服不同措置情况下的最面子家基因。qRT-PCR本事看成抒发款式分析的一种迫切技能，筛选合适的看家基因对qRT-PCR本事实验收尾进行改良瑕瑜常有必要的，粗略耕种收尾的准确性和可靠性。举例，UBQ2和EF1-α基因不仅是茅苍术在通俗条款下抒发较踏实的基因，同期EF1-α基因亦然茅苍术在干旱阻挡下踏实性最好的看家基因[46]；Actin1基因是瓜儿豆在干旱阻挡条款下踏实抒发的看家基因[47]；18S、ACT和TUA基因均可看成岗梅基因接头的理思看家基因[48]。

本接头共登科了为10个植物中较为深广的候选看家基因18S、GAPDH、Actin、TUA、TUB、SAND、EF-1α、UBC、UBQ和cdc25，在GeNorm、NormFinder、BestKeeper和ΔCT 4个模范不同的算法评价下，联接RefFinder网站的详尽分析，评估候选看家基因区别在钩吻4个不同部位(根皮、茎段、叶片和花序)中的抒发踏实性。字据收尾显现，5个软件分析所得收尾基本一致，但仍存在互异性：在钩吻的不同部位中，经GeNorm分析得出，Actin和UBC的踏实性最好；经由NormFinder和ΔCT分析下，EF-1α是候选基因中抒发水平最踏实的；通过BestKeeper分析，基因GAPDH的踏实性最好，变异进度较小，仅次自后的SAND变异进度最小；而通过RefFinder网站详尽其他4个模范的分析收尾得到一个踏实性排行，发现EF-1α是在钩吻不同部位中最适的看家基因。详尽5个模范的分析得出，更安妥营为钩吻在不同部位qRT-PCR实验中的看家基因是EF-1α。

钩吻看成马钱子科的植物，其主要的活性要素钩吻生物碱看成一种吲哚类生物碱，在生物合成经过中与色胺阶梯和环烯醚萜阶梯两个已知阶梯关系。实验收尾中，AS、TSB、TSA、GES、G8H、IS、7-DLGT及SLS基因在钩吻4个部位的抒发水平同钩吻素己在不同部位的相对含量趋势基本一致，标明以上8个基因可能参与钩吻素己的生物合成。同期，经接头发现，8-HGO、7-DLS、7-DLGT以及7-DLH均在植物韧皮部表皮细胞内抒发[25]，这与实验收尾中基因均在茎段有较高的抒发量一致；马钱子酸会从植物的韧皮部出动至叶面的表皮细胞[49]，实验收尾显现，其中关系的SLS、LAMT、STR基因在茎段和叶片中有较高的抒发量，这可能与茎段细胞富含韧皮部、叶面表皮细胞存在于叶片关系联；色胺阶梯中的酶均被定位于叶绿体中，这与关系的酶基因在钩吻叶片中均有抒发的实验收尾一致，包括AS、AnPRT、PRAI、TSA、TSB、IGPS和TDC基因，AS基因在不同的植物中具有组织特异性[50]，是以在根皮的抒发量偏高可能和代谢终居品的大王人积贮联系；TDC基因被说明在萝芙木[51]和喜树的通盘部位均有抒发，且在喜树中的茎段和叶片中抒发较着，在根部的抒发极其狭窄，而这与实验中TDC的抒发水平一致[25]；SGD基因被说明在萝芙木的根、茎段、叶中均有抒发，且茎段和叶片的抒发量较高，这与实验中SGD基因在茎段和叶片中的抒发量较高一致；而PRAI基因主要在根皮中抒发，按序是花序、茎段，叶片中的抒发量最低，这与钩吻素己在根皮中的含量最高，花序和茎段次之，而叶片中含量最低的趋势一致，这评释这条基因很可能是钩吻生物碱生物合成阶梯上的PRAI候选基因之一。

本接头筛选出EF-1α为钩吻在不同部位qRT-PCR分析时最好的看家基因，同期，联接“基因组+全长转录组+代谢组”共抒发关联分析的神色黄sei大片全集，对钩吻生物碱已知的上游合成阶梯关系基因在4个部位的抒发水平进行了接头，为钩吻及马钱科植物其他功能基因抒发款式分析及功能考据奠定了基础。